CAR-T的生产制备流程

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T) 是一种非常有前途的细胞治疗方式。2012年，年仅7岁的艾米丽急性淋巴细胞白血病二次复发，传统的治疗手段毫无作用，艾米丽命悬一线，医生已束手无策。当时的艾米丽抱着试一试的想法，参加了诺华制药的一项CAR-T临床试验，没有想到这款药物使得艾米丽奇迹般地痊愈。CAR-T细胞疗法是一种新型的癌症治疗方法，它使用患者自身的免疫系统来攻击癌细胞，成功解决了传统癌症治疗方法所面临的问题，如治疗效果不佳、副作用大、易复发等问题。

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CAR-T细胞疗法

细胞治疗只是基因治疗的一个分支。成人版快手app

细胞治疗(Cell Therapy)是利用来自患者或供体的活细胞替代受损或患病的细胞或刺激身体免疫反应或再生的治疗方法。用于癌症的细胞治疗通常使用干细胞和免疫细胞。免疫细胞疗法是一种将免疫细胞（主要为T细胞）注入患者以治疗癌症的免疫疗法，主要类型包括嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）、工程T细胞受体疗法（TCR-T）、肿瘤浸润淋巴细胞疗法（TIL）和嵌合抗原受体NK细胞疗法（CAR-NK）。

CAR-T细胞治疗可能是治愈肿瘤的更佳手段。经历TIL、CIK等疗法后，免疫细胞疗法迎来新一代CAR及TCR技术。临床数据显示二者在抗肿瘤领域具有卓越的治疗效果。自从FDA批准CD19 CAR-T产品诺华（Kymriah）上市后，免疫细胞疗法正式进入高速发展阶段。CAR-T为代表的肿瘤免疫治疗被《Nature》杂志认定为科学突破之首，CAR-T也成为免疫细胞疗法中最成熟的技术。

图1 CAR-T细胞疗法的发展进程

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CAR-T的组成

CAR-T，是CAR和T细胞的组合。CAR，即嵌合抗原受体，是能识别“肿瘤标签”的嵌合分子。正常情况下，免疫细胞识别肿瘤细胞是一个复杂的过程，而狡猾的肿瘤细胞往往利用多种方法来逃脱免疫细胞的监察识别，这个过程我们称之为“免疫逃逸”。而CAR-T细胞主要是通过CAR受体识别肿瘤细胞的，因此可以在很大程度上避免肿瘤细胞的免疫逃逸。

图2 CAR-T示意图

从CAR结构相对T细胞的位置来看，CAR主要由三部分组成，包括胞外结构域、跨膜结构域、以及胞内结构域。

图3 CAR的结构组成

胞外结构域：指CAR结构伸出T细胞外的部分，主要由抗原识别结构域（scFv）和铰链区构成。抗原识别结构域是CAR能特异性识别“肿瘤标签”的部位，通常由单克隆抗体演变而来，既保留了对肿瘤抗原的特异性，又增强了对肿瘤的穿透力。铰链区，就像铰链一样，一端连接着抗原识别结构域，另一端连接着CAR的跨膜结构域，增强了抗原识别结构域在空间位置上的灵活性。

跨膜结构域：指CAR横跨细胞膜的部位，主要功能是把胞内部分和胞外部分连接起来，将CAR锚定在T细胞的膜上。大多数跨膜结构域来自天然蛋白，包括CD3ζ，CD4，CD8α或CD28。

胞内结构域：指CAR结构在细胞内的部分，主要功能是把抗原识别结构域受到的刺激信号传递到细胞内，促进T细胞的进一步活化。由共刺激结构域和信号转导结构域组成。共刺激结构域主要功能是协同刺激T细胞活化，使T细胞能更久的维持“战斗状态”，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，主要包括CD28受体家族（CD28）或肿瘤坏死因子受体家族（4-1BB、OX40、CD27）等。信号传导结构域主要发挥信号转导功能，通常选用CD3ζ分子来激活CAR-T细胞。

CAR-T疗法自开创以来历经五代技术更迭，CAR结构的设计是关键：

图4 CAR的发展历程

第一代CAR含有scFv、铰链区、跨膜区及信号转导结构域。由于缺乏共刺激域，仅依赖于CD3ζ介导T细胞激活，并不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的抗肿瘤效应，因此临床疗效有限。

第二代CAR是在第一代的基础上引入了一个共刺激域（CD28或4-1BB），用作激活T细胞活化的“第二信号”，这明显的改善了第一代CAR对T细胞激活不充分的缺点，从而加强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤毒性。研究发现CD28作为共刺激分子时，T细胞杀伤作用强但持续时间短；而4-1BB作为共刺激分子时，持续时间长但杀伤能力有限。临床上应用最多的是第二代CAR-T细胞，在已上市的CAR-T产品中均采用第二代CAR-T技术。

第三代CAR是在第二代的基础上加上了第二个共刺激域（CD28结合4-1BB或CD28结合OX40作为共刺激分子最为常见），增强了T细胞抗肿瘤效应并延长了CAR-T在体内的活性时间，但同时进一步提升了细胞毒性。因此，第三代 CAR-T的临床表现并未优于第二代CAR-T。

第四代CAR在第二代的基础上增加了可以表达特定的细胞因子的功能，又称通用细胞因子介导杀伤的T细胞（TRUCK T），可在激活T细胞的同时分泌相应的细胞因子，如可分泌IL-12，吸引NK细胞和巨噬细胞浸润在肿瘤部位，进一步增强了抗肿瘤效应。

第五代CAR-T，又被称为通用型CAR-T（UCAR-T），即在异体志愿者体内获取T细胞并敲除相关免疫原性基因后制成CAR-T细胞，回输患者体内。主要的优势在于不需要从患者体内获取T细胞进行定制，大大节约了治疗时间和治疗成本。目前，第五代CAR-T的安全性仍处于早期探索阶段。

表1 五代CAR特征对比总结

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CAR-T的生产制备

CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法主要利用患者自身的免疫系统来攻击癌细胞，具有针对性强、治疗效果持久、副作用小等优势。CAR-T细胞制备的核心技术涉及到质粒、病毒、细胞三部分工艺，对制备所需的场所、耗材、设备、人员等都有非常严格的要求。其中，CAR基因的导入是制备CAR-T的关键技术壁垒，所用到的病毒载体的效率与价格是CAR-T生产的关键限制步骤。

整体说来，CAR-T的生产总体可分为质粒、病毒和细胞产品三个部分，细分流程包括：①收集外周血单核细胞（PBMC），分离和富集T细胞；②活化T细胞；③CAR基因的转导；④体外CAR-T细胞的扩增、冷冻保存及运输；⑤最终回输患者体内。在整个过程中，质量控制检测必不可少。从CAR-T的收集到回输，整个流程的耗时大多在10-25天左右。

1) 收集PBMC，分离和富集T细胞

在CAR-T治疗中，需要先从患者的外周血中提取白细胞。此过程常采用密度梯度离心法，利用白细胞重量不同于其他血液成分的特性将其与血清、红细胞等其他血液成分分离，得到外周血单个核细胞（PBMC）。提取出的PBMC需要进一步纯化以分离T细胞。常用的T细胞富集方法有单抗磁珠富集法、逆流淘析法以及密度梯度离心法。单抗磁珠富集法，即利用带有抗CD4/CD8抗体的磁珠，将T细胞从大量白细胞中吸附出来，黏着在磁珠上。

2) 活化T细胞

目前，可以使用CD3/CD28抗体偶联的超顺磁微珠，例如Dynabeads (Gibco™)，用于体外T细胞的活化。此外，还可以通过在培养基中添加OKT3（抗CD3抗体）和IL-2，或者利用人工刺激的抗原提呈细胞（aAPC）来活化T细胞。

3) CAR基因的转导

将CAR基因导入T细胞是制备CAR-T的关键环节，这一步需要利用载体将CAR基因转移到T细胞中。理想的载体应该具有转染效率高、稳定性好，不引起机体免疫反应等特点。目前用到的载体分为病毒载体（如γ-逆转录病毒、慢病毒载体等）和非病毒载体（转座子转染、电穿孔等技术等）。其中，病毒载体具有较高的转染效率和T细胞转导质量，临床应用较多，占到了所有转染方式的95%。

慢病毒转染是目前基因转导的主要方法。慢病毒载体的生产过程需要满足GMP级别要求、需要进行额外的放行检测、需要昂贵的转染试剂和质粒、需要瞬时转染大量的质粒DNA、需要进行可复制病毒的检查等，其高昂的生产成本也是CAR-T定价居高不下的一个主要原因。

4) 体外CAR-T细胞扩增、冷冻保存及运输

体外扩增T细胞是CAR-T疗法面临的关键挑战之一。因为许多患者身上只能分离少量T细胞，在通过基因修饰获得稳定的CAR-T细胞后，想要达到合适的治疗剂量，一般为十亿至百亿级别（根据患者体重和治疗周期决定），就需要充分扩增T细胞。目前，可以通过不同的容器包括T瓶、平板、培养袋、Wave反应器、G-Rex及CliniMACS Prodigy来扩增细胞。类似CliniMACS Prodigy（美天旎，德国）这样的自动化细胞生产设备可以集细胞的制备、富集、刺激、转导、扩增、以及最终的收集和采样等功能于一体化，大大减少了人为操作，比较适合临床中T细胞的制备。

当CAR-T细胞扩增完成，细胞培养体积达到5L时，需将细胞进行清洗后浓缩至一定体积冻存起来，接着经过产品放行，将冷冻保存的细胞运输至目的地再解冻回输给病人。

5) 回输患者体内

临床常用静脉输液的方式将CAR-T细胞输回患者体内。为了减少肿瘤细胞的数量，避免过于严重的细胞因子风暴，在细胞回输前临床上往往会进行化疗。

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CAR-T的生产中的过程控制

FDA规定CAR-T细胞临床试验样品必须经IND（新药临床申请试验）批准在GMP条件下生产。根据CAR-T药物的研发与生产特点，CAR-T细胞药物的研发与生产场所应至少包括质粒工艺区、病毒工艺区、细胞工艺区、质控区和仓储区，各个区域应相对独立。同时根据设备或工艺特点，配备足够的辅助性功能区。在这些区域使用的材料和设备必须尽量减少颗粒物（使用洁净室级钢、其他材料等）和生物或化学污染的机会。应监测周期性好氧和厌氧微生物负荷。

此外，CAR-T产品所用的物料一般包括所使用的试剂耗材、生物活性因子以及与细胞制剂直接接触的包装材料及外包装材料等，CAR-T的生产要求必须有可靠的物料管理体系。

为确保最终产品的质量，CAR-T的生产过程还应建立质量控制（QC）流程和程序。QC应通过适当的检测以确保每批产品生产的所有关键工艺步骤符合标准并保持无菌，并确保使用的所有物料符合规定的标准。应当建立安全、有效处理不合格供体材料、中间产品、成品、过期留样样品的操作规程，处理应当有记录。细胞治疗产品放行前的质量评价应当确认每批产品的信息完整、正确且可追溯，否则不得放行。

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CAR-T疗法商业化仍面临挑战

尽管CAR-T优势显著，但其商业化也面临了巨大挑战，主要体现在以下三个方面：

安全性问题：目前，比较公认的影响CAR-T安全性问题的因素主要有细胞因子释放综合症（CRS）、脱靶效应及神经系统毒性（NT）。其中≥3级CRS表现为低血压、缺氧、高胆红素血症、低纤维蛋白原血症、急性呼吸窘迫综合征、心房颤动、肝细胞损伤、代谢性酸中毒、肺水肿、多器官功能障碍综合征和HLH/MAS；神经毒性表现为暂时性的记忆丧失、神志不清、癫痫发作，很少出现急性脑水肿。CRS和神经毒性均归因于分泌细胞因子的T细胞的快速活化和扩增。为此，CAR-T产品目前仅适用于特定的复发或难治性肿瘤患者。

表2 已上市CAR-T药物毒性临床结果

2）治疗费用高昂：目前上市产品中价格最高的为Kymriah，高达47.5万美元/针。此外，CAR-T产品价格也在逐渐上涨，Abecma单价由41.95万美元/针上涨至43.8万美元/针。根据Nature Reviews Drug Discovery的调查显示，有65%的患者表示CAR-T产品昂贵的价格是其无法接受细胞疗法最大的障碍，超过是否满足指征和疾病进展情况。

3）产能扩增受限：全球病毒载体供应短缺限制了CAR-T的产能扩增。生产病毒载体的制造过程复杂、成本高昂。根据J.P.Morgan统计，截至2021年基因治疗外包渗透率超65%，远大于传统生物制剂的35%。而企业委托相关CDMO企业生产平均需要等待16个月，部分情况下可能需要等待两年。

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CAR-T的研究现状成人版快手app

已上市及申请上市CAR-T细胞。

Yescarta销售额超10亿美元，CGT的开发达到重要里程碑。

CAR-T疗法靶点集中度较高。

靶向CD19的CAR-T疗法数量最多，血癌领域国内外靶点布局差异不大，竞争激烈，国内外实体瘤靶点布局尚有差异化空间。

相比国外，国内针对已上市靶点CD19和BCMA研发布局更多，处于早期临床阶段项目比例高。

双靶点CAR-T研发靶点组合多样性较低，CD20和CD22为主要组合选择，多个靶点均有抗体药物上市，适应症高度重合。

国外及中国已上市CAR-T靶点在研药物阶段统计（不含上市药品）

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